Іони купруму (ІІ) підвищують цитотоксичний вплив рекомбінантного альфа-синуклеїну людини на клітини дріжджів Ogataea polymorpha

Abstract

Відомо, що в білкових агрегатах нейронів людей, які страждають на хворобу Паркінсона (ХП), можна виявити підвищені рівні певних іонів металів (як-от цинк, залізо та купрум). Взаємодіючи з білками, ці метали впливають на властивості окремих ділянок мозку та призводять до нейродегенеративних змін. На сьогодні існує широкий спектр моделей для дослідження різних аспектів етіопатогенезу ХП in vivo, які базуються на використанні різних модельних організмів – від одноклітинних еукаріотів до приматів. Як штучну модель ХП в нашій роботі ми використовували дріжджі Ogataea polymorpha з конститутивною експресією рекомбінантного білка альфа-синуклеїну людини, головного токсичного чинника ХП. Метою роботи було дослідити вплив надлишку іонів купруму в ростовому середовищі на фізіологічні властивості клітин дріжджів O. polymorpha з конститутивною експресією альфа-синуклеїну. Штами дріжджів вирощували в багатому середовищі YPS (1% дріжджовий екстракт, 1% бактопептон, 1% сахароза), мінеральному середовищі YNB (0,67% Yeast Nitrogen Base (Difco), 0,5% амонію сульфат, 2% сахароза). Для твердих середовищ додавали агар у концентрації 2%. Температура культивування становила 37 °С, умови аерації – перемішування на термостатованому орбітальному шейкері (200 об/хв). Усі експерименти повторювали принаймні тричі. Статистичний аналіз проводили за допомогою Т-тесту Стьюдента. Результати представлені у вигляді середніх значень зі стандартними помилками. Враховували значення за P ≤ 0,05. Під час дослідження було встановлено, що збільшення концентрації Cu2+ у ростовому середовищі до 500 та 750 мкМ CuCl2 спричиняло помітний токсичний ефект на клітини модельного штаму (NCYC 495/SNCA-GFP), порівнюючи зі штамом дикого типу (NCYC 495 pr). Також було з’ясовано, що в модельного штаму дріжджів за таких умов культивування рівень АФО, а саме гідрогену пероксиду, був нижчим, ніж у штаму дикого типу. Імовірно, завдяки хелаторним властивостям білка альфа-синуклеїну щодо іонів купруму участь цього металу в ініціації оксидативного стресу обмежувалася і, як наслідок, знижувалася продукція АФО. Оскільки гідрогену пероксид є основним субстратом каталази, ферменту системи антиоксидантного захисту, було проаналізовано активність цього ферменту на тлі надлишку іонів купруму в ростовому середовищі. За концентрації Cu2+ 250 мкМ активність каталази в обох досліджуваних штамів дріжджів була найвищою, однак за 500 мкМ вона знижувалася. Такий ефект можна пояснити тим, що за високих концентрацій купрум діє як денатуруючий агент щодо білка каталази, призводячи до її інактивації. Слід зазначити, що надлишок іонів Cu2+ не викликав агрегації альфа-синуклеїну, проте підвищував цитотоксичний ефект цього білка на клітини модельного штаму.